鱟血變形細(xì)胞裂解物的制備

采用我國(guó)東南沿海地區(qū)的鱟即東方鱟（中國(guó)鱟），采血量最多為400ml，平均200ml（需根據(jù)體重大小而定），其變形細(xì)胞數(shù)最高為5×10¹¹/L以上，平均為4×10¹⁰/L。

準(zhǔn)備采血瓶（250ml玻璃瓶）注射器等用具，經(jīng)洗滌后放在重鉻酸鉀與硫酸的清潔液中浸泡過(guò)夜，然后用無(wú)內(nèi)毒素的流水沖洗3次，晾干后于260℃烤箱內(nèi)烘干3h備用。采血針、管均需用一次性無(wú)菌采血器（均無(wú)內(nèi)毒素）。

以下試劑中凡是固體試劑均需預(yù)先去除內(nèi)毒素，去內(nèi)毒素的方法要視各種試劑的耐熱度而定，一般用80~120℃不間斷烘烤約10h左右。配制試劑用的重蒸餾水應(yīng)不含內(nèi)毒素（小于0.03EU/ml內(nèi)毒素含量）。

1. 抗凝劑1：茶-堿（theophylline）2g；磷-酸-氫-二-鈉（Na₂HPO₄·12H₂O）2g；氯化鈉40g；無(wú)內(nèi)毒素蒸餾水1000ml。

2. 抗凝劑2：茶-堿0.36g；磷-酸-氫-二-鈉2g；氯化鈉4g；無(wú)內(nèi)毒素蒸餾水1000ml。

（3）洗滌液：磷-酸-氫-二-鈉2g；氯化鈉40g；無(wú)內(nèi)毒素蒸餾水1000ml。

（4）裂解液：將0.05mol/L的三羥甲基氨基甲烷（Tris）用鹽酸調(diào)節(jié)至pH值為7左右，也可加入二價(jià)陽(yáng)離子如Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺等提高靈敏度。
二、制備步驟

1、采血 
取活鱟用水沖洗，將鱟屈曲，露出頭、胸、腹三節(jié)交界處，用碘酒擦拭后用酒精消毒。取15G針頭一次性輸血器，針尖插入盛有100ml抗凝劑1的瓶中，另一端的針頭刺入鱟的頭腹部關(guān)節(jié)處深入約1～2cm，藍(lán)色血液就流入瓶?jī)?nèi)，每瓶采血100ml，注意穩(wěn)定針頭，使其不要移動(dòng)。在采血過(guò)程中，鱟血應(yīng)是順暢地流入瓶中，若發(fā)生間歇滴入就容易凝固，應(yīng)即棄去不用。采血后立即用1000r/min離心約2min。離心后，變形細(xì)胞沉積于瓶底，呈白色，此時(shí)棄去上層藍(lán)色血液即可。

2、洗滌
用抗凝劑2-20ml加入瓶中輕輕搖晃，使沉淀的變形細(xì)胞均勻地分散混懸于抗凝劑中，然后以1000r/min離心1min。棄去上清液后用4%氯化鈉磷酸鹽溶液洗滌3次，之后再次離心約1500r/min 1min，將細(xì)胞壓實(shí)，棄去上清液。

3、裂解
將壓實(shí)的變形細(xì)胞加入約3倍裂解液后使細(xì)胞計(jì)數(shù)在5×10¹¹/L，變形細(xì)胞100ml沉淀物加裂解液10ml。然后放置于4℃的冰箱內(nèi)，每天震蕩2次，以使細(xì)胞裂解完-全。析出的液體應(yīng)透明無(wú)色。

4、分裝凍干
將裂解物以3000r/min離心15min，收集上清液分裝于安瓻中，放置于醫(yī)用冷凍干燥機(jī)中，-30℃快速冷凍，然后于真空狀態(tài)下升溫干燥，升溫不超過(guò)20℃。冷凍干燥后即可得到標(biāo)準(zhǔn)靈敏度的鱟試劑成品。
三、制品檢測(cè)

1、使用凝膠法進(jìn)行鱟試劑成品內(nèi)毒素測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素含量為10EU/支，準(zhǔn)確加λ無(wú)內(nèi)毒素用水（以下簡(jiǎn)稱水）1.0ml，溶解，用封口膜封住安瓿口。

2、將封口安瓿放λ旋渦混合器上旋渦混合，一般情況下國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品是20~30min，工作標(biāo)準(zhǔn)品是10~15min（其要求的理由下述會(huì)闡明）混合時(shí)注意不要使安瓿內(nèi)溶液沾上封口材料。

3、將混合好的內(nèi)毒素溶液（此時(shí)濃度為10EU/ml）用水稀釋為2λ、λ、0.5λ及0.25λ濃度的系列濃度（λ為靈敏度），即1.0、0.5、0.25、0.125EU/ml濃度的系列溶液。

4、操作方法：①取20支無(wú)內(nèi)毒素試管分為4組，每組分別標(biāo)記上E1、E0.5、E0.25、 E0.125、E0（空白管陰性對(duì)照）。②分別吸取鱟試劑0.1ml 加入E0至E1的對(duì)應(yīng)試管。③E0管加入0.1ml水，其余各管加入0. 1ml與管上標(biāo)注數(shù)字相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素。④用封口膜封閉試管，將試管內(nèi)容物輕輕搖勻。⑤把試管架放入37±2℃的恒溫水浴中保溫60±2min。在保溫過(guò)程中不能有任何震動(dòng)，以免影響反應(yīng)的正常進(jìn)行。保溫時(shí)間結(jié)束后將試管取出觀察結(jié)果，注意，E0管需保溫至4h才取出觀察結(jié)果。⑥實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷：將試管緩慢翻轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)凝膠顯示堅(jiān)實(shí)不變形為陽(yáng)性，記錄為“+"；若無(wú)凝膠出現(xiàn)﹐或疑有凝膠但不能保持完整，從管壁滑脫，均判為“陰性"，記錄為“－"。