鱟試驗方法——用產色基質法檢測細菌內毒素含量的方法

日本學者對內毒素的產色基質測定法（Chromogenic subs-trate method）進行了大量的研究。從鱟試驗的反應機理可知，鱟試劑中含有一種特異的前凝固酶，其受內毒素激活后變成有活性的凝固酶，后者具有α-凝血酶的活性及Xa因子及XⅡa因子的一些功能。這種酶可水解凝固蛋白原成三個片段，即A鏈、B鏈及C肽。A、B鏈和C肽再通過共價相聯(lián)而成為凝膠。此酶作用的部位，分別為A鏈羧基端的-Val-Leu-Gly-Arg（Gly，Arg 分別為第17、18位）及C肽的-Val- Ser-G1y-Arg（G1y，Arg分別為第45、46位）上，提示羧基末端Gly-Arg的結構可受到鱟血凝固酶的作用。鑒于此，利用人工合成的肽-硝基苯胺.（肽一PNA）或肽-4甲基香-豆素酰胺（肽-MCA）基質中肽段氨基酸排列順序與凝固蛋白質切斷部位的氨基酸排列順序相同的特性，就可以由于這種酶的水解作用，使產色基質游離出來，即可用分光光度計于適當的波長處測得吸光度。

如用肽-PNA基質，則釋出的為PNA，可在405nm處測定吸光值。如用肽-MCA基質，即釋出7-氨基-4-甲基香-豆素（AMC）經380nm波長紫外線激發(fā)后，在460nm處可測得熒光，如用370nm波長亦可測知AMC的游離量。

目前應用的產色基質有許多種，主要有:

Bz - lle - Glu - Gly -Arg - PNA

Bz - Val - Gly - Arg - PNA

Boc - Lue - Gly - Arg -PNA

Boc - Lue - Gly - Arg - PNA

Boc - Ser - Gly - Arg - PNA

Boc - Leu - Gly -Arg - MCA

Boc - Ser - Gly - Arg- MCA等。

這些基質對鱟凝固酶的酰胺酶感性隨內毒素濃度的提高和作用時間的延長而增強，顯示其高度的專一性。測出內毒素的范圍為5Pg-50ng/ml。反應時間延長測得更低的內毒素值。反應需要的最適pH為8.0～8.5。

在試驗時必須作陽性標準管，即以一定濃度（如0.100，0.025，0.075ng/ml）的標準內毒素與肽-PNA或肽-MCA反應，然后作出線性標準曲線。作出的標準曲線，其相關系數應＞0.98，變異系數＜5 %。被檢樣品的吸光值只要與標準曲線比較，即得知標本中所含的內毒素量。亦可采用下列公式求得如下圖:

如果要測定血漿或血清中的內毒素，則由于其中含有內毒素抑制蛋白，可事先加熱37℃30分鐘，以破壞這些抑制物質，或通過稀釋的方法消去這些抑制物質。亦可在血清中加入標準內毒素作出標準曲線。